Sık Sorulan Sorular

Genel tanımlamalarla ilgili cevaplar...

Termal Protokol Nedir?

Termal Protokol;  DNA  molekülünün erimesi ve enzimatik olarak çoğalması için gereken reaksiyonu gerçekleştirmeye yarayan,  tekrar eden  ısıtma ve soğutma döngülerinden  oluşan  PCR  programı/protokolüdür.

CT nedir?

CT (cycle threshold),gerçek zamanlı  PCR deneylerinde floresan sinyal miktarının, gözlemlenebilmesi için gereken minimum değeri (eşik değerini) geçtiği döngü  sayısına (eşik döngüsü) verilen addır.


Çifte işaretli prob nedir?

TaqMan probu diye de bilinen, 5’ ucundan bir “reporter” floroforla, 3’ ucundan ise “quencher” diye adlandırılan bir grupla işaretlenmiş, Taq polimeraz tarafından hidrolize edilerek ışıma yapan, dizisi çoğaltılan DNA bölgesine komplementer bir DNA parçasıdır.

Tm (Erime sıcaklığı) nedir? Erime sıcaklığı (Tm), DNA molekülünün yarısının tek sarmal haline geldiği belirli sıcaklığa verilen addır. Erime sıcaklığını büyük ölçüde baz dizisi belirler, ve farklı dizilere sahip DNA moleküllerinin Tm değerleri birbirinden farklı olur.


Melt Curve Analysis/Erime Eğrisi Analizi nedir?

Erime eğrisi analizi, SYBR-Green vb floresan boyaların kullanıldığı analizlerde, çoğalan DNA’nın hedef bölge olduğunu kesinleştirmek amacıyla kullanılır. Erime eğrisi analizinde, ikili sarmal DNA örneğinin sıcaklığı yavaş yavaş artırılarak floresan sinyalin sıcaklığa bağlı değişimini gösteren bir grafik oluşturulur. Floresan sinyalin ani düşüşünden kaynaklanan tepecikler aracılığıyla, DNA iplikçiklerinin birbirlerinden ayrılmaları gözlemlenir.


Negatif kontrol nedir?

Negatif kontrol, içinde test edilen madde hariç bütün reaksiyon içeriğini barındıran kontrole verilen addır. Her Real-Time PCR çalışmasına bir adet negatif kontrol; yani içinde her malzemeyi barındırıp sadece test edilen genetik materyal bulunmayan bir reaksiyon tüpü, dahil edilmelidir. Bu, olası bir  kontaminasyonun varlığının kontrol edilmesini sağlar, pozitif hasta sonuçlarının anlamlı olduğunu kanıtlar.


Pozitif kontrol nedir?

Pozitif test sonucu vereceği bilinen ve pozitif sonuç vermesi beklenen reaksiyon kontrolüdür. Pozitif kontrol, uygulamadaki veya kullanılan malzemelerdeki olası aksaklıkların ortaya çıkarılmasını sağlar. Pozitif kontrol pozitif sonuç vermezse, o deneyin sağlıklı olmadığı anlaşılır. Doğru sonuçların verildiğinden emin olmak için deney tekrarlanır.


Nükleik asit standardı nedir?

Kantitatif analizlerde kullanılmak amacıyla miktarı ölçülmüş (konsantrasyonu bilinen)  nükleik asit örneğidir. Standartlar, sadece kantitasyonu yapılmak istenen hedef gen/patojenin DNA/RNA miktarını yansıtır. Bazen karıştırılabildiği üzere, standartların internal kontrol ile bir bağlantısı yoktur, internal kontrolün saptandığı filtrede standart eğri çizdirilemez.


İnternal (iç) kontrol nedir?

Bir PCR çalışmasında, test edilen bölgeden farklı bir bölgenin daha çoğaltılmasıdır. Böylelikle, bir reaksiyon tüpünde iki ayrı PCR yapılmış olur. İnternal kontrolün kullanılmasıyla, testin sorunsuz çalıştığı kontrol edilmiş olur ve yanlış negatif (false negative) sonuçların verilmesi engellenir. İnternal kontrol kullanıldığı aşamaya bağlı olarak, nükleik asit izolasyonunu ve/veya PCR aşamasını kontrol altında tutar. İnternal kontrolün arttığı fakat test probuyla artış alınamayan örneklerin negatif olduğu anlaşılır. Bir örnekte, testin hedef patojen/geninde amplifikasyon yoksa, ve internal kontrol de artmamışsa deney tekrarlanmalıdır. İnternal kontrol artmıyor ancak örnek test prob ile artıyorsa deneyin tekrarlanmasına gerek yoktur.   Bunun nedeni, internal kontrolün, testin hassasiyetini olumsuz yönde etkilemeden hafif artış gösterecek şekilde tasarlanmış olmasıdır. Hem test hedef PCR’ı hem de internal kontrol PCR’ı, aynı kuyucukta birbiriyle yarış halinde gerçekleştiğinden, test hedefi açısından yüksek pozitif olan örneklerin internal kontrolü baskılaması normaldir. İnternal kontrolün sadece 4. Standartta, düşük pozitif ve negatif örneklerde artması uygun ve yeterlidir.


Çifte işaretli prob ve SYBR-Green tabanlı kitlerde, floresan ölçümü ve ürünün saptanmasıyla ilgili farklılıklar var mıdır?

Evet. Çifte işaretli hidroliz probları kullanan (TaqMan temelli) kitlerde floresans ölçümü, PCR’ın Taq Polimerazın probu kestiği “annealing+elongation” evresinde, (genellikle 50-60°) alınır. SYBR-green diziye özgü olmadığı için primer dimerleri vb. gibi hedef ürünün dışındaki çift zincirli DNA yapılarını da görüntüler. Bu nedenle SYBR-green bazlı kitlerde, primer dimerlerinin tek zincirli olduğu,  hedef PCR ürününün ise çift zincirli olduğu bir sıcaklıkta ölçüm yapılmalıdır. Bu sıcaklık da yaklaşık olarak ürünün Tm’ine, ya da bir-iki derece altına denk gelir. Böylece, mümkün olduğunca, primer dimerlerden kaynaklanan floresans artışlarından kurtulmuş olunur ve spesifik olarak ürünün artışı izlenir.

Çifte İşaretli Prob temelli kitlerde PCR ürünü baz dizisi o ürüne özgü floresan işaretli problarla görüntülenir, bu yüzden çoğalan ürün spesifik biçimde saptanmış olur. SYBR-green kullanılan kitlerde ise, SYBR-green dizi ayrımı yapmaksızın tüm çift zincirli DNAlara bağlandığı için PCR ürünü spesifik olarak görüntülenemez. Kendi aralarında sekonder yapılar oluşturmayan primerler seçilmesi, ya da primer sekonder yapıların (dimer) Tm’inin üzerinde bir sıcaklıkta ölçüm alınması yoluyla yalnızca PCR ürününe bağlı artışın gözlemlenmesi mümkündür. Ancak PCR ürününün spesifik olarak saptanması erime eğrisi analizi (melt curve analysis) yoluyla kesinlikle sağlanabilir.


Kantitatif kitlerde en az kaç standartla çalışmak gereklidir?

Standart eğri oluşturmak için en az 3 standartla çalışmak gereklidir.


Bazı termal protokollerde ilk denatürasyon basamağının 15 dakika olmasının sebebi nedir?

Bazı kitlerde kullanılan Taq Polimeraz, “HotStarTaq Polymerase” olarak bilinen ve 95°C’de aktive olan bir polimerazdır. Bu polimerazı kullanmanın avantajı tek basamaklı RT-PCR kitlerinde görülmektedir:
“HotStarTaq Polymerase”, revers transkripsiyon (RT) aşamasında inaktif kalacak biçimde modifiye edilmiştir. Bu sayede revers transkripsiyon aşamasında yanlış eşleşmiş bazların ya da primer dimerlerin çoğalımı engellenmiş olur. “Hot Start” olarak adlandırılan 95°C’lik denatürasyon basamağı ayrıca revers transkriptaz enziminin aktivasyonunu tamamen yitirmesine de yol açar ve revers transkripsiyon ile PCR aşamaları tam anlamıyla birbirinden ayrılmış olur.


PCR verimi nasıl hesaplanır?

PCR verimi standart eğrinin eğimi ile doğru orantılıdır (Verim = [10(-1/eğim)] – 1). Buna göre -3.332’lik bir eğim %100’lük bir verime karşılık gelir. Verimin mutlak değerinin 3.332’den büyük olması verimin %100’den düşük olduğunun, küçük olması ise %100’den büyük olduğunun göstergesidir ki, her iki durumda da reaksiyonun optimize edilmesi gerekir. %100’lük verimde template her döngüde 2’ye katlanır. Gerçekte hiçbir PCR reaksiyonunun bu değere erişmediği bilinmektedir. Çoğaltılan bölgenin (amplicon) uzunluğu, sekonder yapılar ve primer kalitesi gibi faktörler PCR verimini etkileyebilir.